Nước cất dùng phân tích thí nghiệm Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao HPLC

 Nước cất tên tiếng anh là distilled Water hay còn gọi là nước tinh khiết. Tùy theo số lần cất mà người ta gọi là nước cất 1 lần, nước cất 2 lần hay nước cất 3 lần. Tương tự cũng có thể gọi là nước tinh khiết loại 3, nước tinh khiết loại 2, nước tinh khiết loại 1.

 Nước cất 1 lần tương ứng với nước tinh khiết loại 3, nước cất 2 lần tương ứng với nước tinh khiết loại 2 và nước cất 3 lần tương ứng với nước tinh khiết loại 1. Nước tinh khiết loại 1 còn được gọi là nước siêu tinh khiết).

Với thông số tiêu chuẩn, nước cất tinh khiết Lam Hà đủ điều kiện đáp ứng tiêu chuẩn thí nghiệm. Ứng dụng nước cất vào hoạt động phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) HPLC là viết tắt tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography). Hay còn gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968. Trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn.

 HPLC đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn. Hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp HPLC ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao. Khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.

 Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng. Như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia trong lĩnh vực thực phẩm. Phương pháp này cũng có tính dụng cao trong công nghê nghiên cứu sản xuất dược phẩm, môi trường...

Sơ đồ hệ thống phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 

2.1 Phân loại sắc ký lỏng HPC

• Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

• Sắc ký phân bố (partition chromatography)

• Sắc ký ion (ion chromatography)

• Sắc ký rây phân tử (size exclusion/ sắc ký cột gel permeation chromatography)

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất. SKPB có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến phân cực. Hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000). SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động:

• Sắc ký pha thường - SKPT normal phase chromatography

• Sắc ký pha đảo - SKPĐ reversed phase chromatography

 SKPT pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để tách. Đồng thời phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.

 SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ.

 Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực. Trong đó dung môi nước cất đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền. Vì thế SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT.

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

• Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý

→ sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).

• Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền

→ sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)

 Trong quá trình sử dụng nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng - lỏng. Vì một số nguyên nhân sau:

• • Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng HPLC - lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động. Nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.
  • Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động. Nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.

 Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết. Và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này. Bề mặt các hạt silica – SiO₂ (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm). Nó được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong 1 đến 2 ngày. Để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thông thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):

                                                                    Hình 1. Bề mặt silica đã thủy phân 

Sắc Ký Pha Tĩnh Không Phân Cực, Trung Bình

Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan. Để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.

                                                                   Hình 2: Tạo nhánh trên bề mặt silica 

 Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl tức < 4µmol/m2 bề mặt bị silan hóa. Vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể. Ngoài nhóm Cl người ta còn sử dụng –OCH3. Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại. Bởi những lực lượng tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh.

 Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS- Octadecylsilan. Hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl.

 Trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác. Nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất.

 Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm –OH chưa phản ứng. Gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường pH phân tích. Trong môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-C18) ra khỏi nền.

 Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không còn tương tác tốt với pha tĩnh nữa. Trong môi trường baz (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hòa tan SiO₂ thành silicat. Hệ quả là N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi rộng ra và thời gian lưu có thể giảm. Kết quả phân tích như vậy sẽ mất đi độ chính xác.

 Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan ít sử dụng hơn. Để tương tác với nhóm –OH này (gọi là hiện tượng end-capping). Lúc này ta sẽ có loại cột ít tương tác với chất phân tích có tính baz (cột LC-DB của hãng SUPELCO).

 Hình 4. Cấu trúc cột LC-DB 

 Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác với nó. Đó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl. Để những nhóm này sẽ che đi những nhóm –OH, cản trở tương tác của nhóm –OH với chất cần phân tích.

                                                                     Hình 5: Cấu trúc cột có gốc isopropyl 

  Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase – PRP). Cho phép phân tích trong môi trường pH từ 1 – 13. Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và baz mạnh.

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

• Hòa tan mẫu phân tích.
• Phù hợp với đầu dò.
• Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.
• Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.
• Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade).

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi. Nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất.

Nước cất tinh khiết là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải. Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý. Như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point). Và độ phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength)… Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký.

3.1 Ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký lỏng:

• Số đĩa lý thuyết N
• Hệ số dung lượng K’
• Độ chọn lọc α .

 Khi sự thay đổi thành phần pha động không đem lại kết quả tách mũi theo yêu cầu. Thì chúng ta phải thay đổi bản chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α. Đôi khi có thể phải thay đổi cả pha tĩnh. Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động. Phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính baz (nhận proton) của dung môi.

  Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước cất. Hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước. Nước cất tinh khiết là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl. Không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất. Và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ. Hỗn hợp nước cất và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột.

                                                              

                                 Hình 6: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25^oC 

3.2 Lựa chọn dung môi cho phân tích sắc ký lỏng HPLC

 Việc lựa chọn thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/ nước cất.

 Với một hỗn hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước cất. Khi lựa chọn thì phải chọn các hỗn hợp MeOH, ACN và THF với nước cất có độ rửa giải tương đồng.

 Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic). Hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradient dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.

4. Một số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký lỏng

 4.1. Hệ số phân bố hệ sắc ký

  Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình như sau:

                          

 Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố. Hay hằng số phân bố (partition coefficient) và được tính như sau:

                                       

 Với CS   : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh. CM  : nồng độ cấu tử trong pha động. Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.

4.2. Thời gian lưu:

 tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột. tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết. tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử.

                                                   

                                                         Hình 7. Thời gian lưu của cấu tử phân tích 

4.3. Hệ số dung lượng k’

  k’ được định nghĩa theo công thức sau:

                             

 Với VS   : thể tích pha tĩnh VM  : thể tích pha động

Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại. Nếu k’ càng lớn (tR  càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù. Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20.

4.4. Hiệu năng

 Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng tách càng cao. Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ. Người ta chứng minh được:

                                  

 Với W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút) W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút)

4.5 Độ chọn lọc

 Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.

                 

4.6. Độ phân giải:

 Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau:

 

                             

 

 Với N được xác định từ phương trình (2.5) hoặc (2.6). Trên đây là phần mô tả khái quát về phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Trong phần tiếp theo Lam Hà sẽ cập nhật thêm những ứng dụng của Nước Cất Tinh Khiết. Cũng như bổ sung chi tiết hơn Nguyên lý hoạt động của phân tích sắc ký lỏng trong hoạt động thí nghiệm.  

Nguồn: Case.vn